Зубчатая извилина гиппокампа в мозге взрослого млекопитающего содержит нейральные стволовые / предшественники (NS / PC), способные генерировать новые нейроны, т.е. нейрогенез. Большинство изученных на сегодняшний день наркотиков, вызывающих злоупотребление, снижают нейрогенез гиппокампа у взрослых, но влияние каннабиса (марихуаны или каннабиноидов) на нейрогенез гиппокампа остается неизвестным. Это исследование было направлено на изучение потенциальной регуляторной способности мощного синтетического каннабиноида HU210 на нейрогенез гиппокампа и его возможной корреляции с изменением поведения. Мы показываем, что NS / PC гиппокампа как эмбрионов, так и взрослых крыс иммунореактивны по отношению к каннабиноидным рецепторам CB1, что указывает на то, что каннабиноиды могут действовать на рецепторы CB1, регулируя нейрогенез. Эта гипотеза подтверждается дополнительными данными о том, что HU210 способствует пролиферации, но не дифференцировке,i / o белки и передача сигналов ERK. Хроническое, но не острое лечение HU210 способствовало нейрогенезу в зубчатой извилине гиппокампа взрослых крыс и оказывало анксиолитический и антидепрессантный эффекты. Рентгеновское облучение гиппокампа блокировало как нейрогенные, так и поведенческие эффекты хронического лечения HU210, предполагая, что хроническое лечение HU210 вызывает анксиолитические и антидепрессантные эффекты, вероятно, за счет стимуляции нейрогенеза гиппокампа.
Каннабис (марихуана, гашиш или каннабиноиды) использовался в медицинских и развлекательных целях на протяжении многих веков и, вероятно, является единственным лекарством или запрещенным наркотиком, который постоянно вызывает огромный интерес или споры как в общественном достоянии, так и в медицинских исследованиях. Каннабиноиды, по-видимому, способны регулировать боль, тошноту, рвоту, эпилепсию, ишемический инсульт, церебральную травму, рассеянный склероз, опухоли и другие заболевания у людей и / или животных ( 1 —7 ). Однако марихуана была наиболее часто используемым запрещенным наркотиком в развитых странах, вызывая острое нарушение памяти и симптомы зависимости / абстиненции у хронических потребителей и животных моделей (6 ,8 —10 ). Каннабис действует на 2 типа каннабиноидных рецепторов, рецепторы CB1 и CB2, которые распределены в основном в головном мозге и иммунной системе соответственно. В головном мозге рецепторы CB1 также нацелены на эндогенные каннабиноиды (т.е. эндоканнабиноиды), такие как анандамид (AEA), 2-арахидонилглицерин и арахидонилэтаноламид (1 ,6 ,10 ,11 ).
Недавнее открытие, что гиппокамп способен генерировать новые нейроны (т.е. нейрогенез) на протяжении всей жизни млекопитающих, включая человека, изменило наше представление о механизмах психических расстройств ( 12 ) и наркомании (13 ). Субгранулярная зона зубчатой извилины (SGZ) во взрослом мозге содержит нейральные стволовые / предшественники (NS / PC), способные производить тысячи новых гранулярных клеток в день (14 ). Мы и другие показали, что эти новорожденные нейроны гиппокампа функционально интегрированы в существующие нейроанатомические схемы (15 ,16 ) и положительно коррелируют с процессами обучения и памяти, зависящими от гиппокампа (17 ) и механизмы развития стресса и расстройств настроения (12 ). Недавние исследования также показали, что хроническое лечение флуоксетином вызывает антидепрессивный и анксиолитический эффекты (18 ,19 ), а анксиолитические эффекты, вероятно, достигаются за счет стимуляции нейрогенеза в гиппокампе (18 ).
Сообщалось, что хронический прием основных наркотиков, вызывающих злоупотребление, включая опиаты, алкоголь, никотин и кокаин, подавляет нейрогенез гиппокампа у взрослых крыс ( 20 —23 ), предполагая потенциальную роль нейрогенеза гиппокампа в инициации, поддержании и лечении наркозависимости (13 ). Недавнее открытие заметно сниженного нейрогенеза гиппокампа у мышей с нокаутом CB1 (24 ) предполагает, что активация рецептора CB1 эндогенными, растительными или синтетическими каннабиноидами может способствовать нейрогенезу в гиппокампе. Однако сообщалось, что эндогенные каннабиноиды ингибируют нейрогенез гиппокампа у взрослых (25 ). Тем не менее, возможно, что экзо- и эндоканнабиноиды могут по-разному регулировать нейрогенез в гиппокампе, поскольку экзо- и эндоканнабиноиды действуют как полные или частичные агонисты рецепторов CB1 соответственно (11 ).
Целью настоящего исследования было проверить гипотезу о том, что мощный синтетический каннабиноид HU210 способен стимулировать нейрогенез в гиппокампе, что приводит к анксиолитическим и антидепрессивным эффектам каннабиноидов. Мы демонстрируем здесь, что и HU210, и эндоканнабиноидные AEA способствуют пролиферации эмбриональных NS / PC гиппокампа без значительного воздействия на их дифференцировку, что приводит к большему количеству новорожденных нейронов. Эффекты HU210 на нейрогенез в гиппокампе взрослых были количественно оценены на свободно передвигающихся крысах и коррелированы с поведенческими тестами. Мы показываем, что через 1 месяц после хронического лечения HU210 у крыс наблюдается увеличение количества новорожденных нейронов в зубчатой извилине гиппокампа и значительно сниженные показатели поведения, подобного тревоге и депрессии. Таким образом,
Полученные результаты
Экспрессия рецепторов CB1 в эмбриональных и взрослых NS / PC гиппокампа. В головном мозге млекопитающих рецептор CB1 является одним из самых распространенных рецепторов, связанных с G-белком, на который приходится большая часть, если не все, центрально-опосредованные эффекты каннабиноидов ( 5 ). Мы рассудили, что если бы каннабиноиды могли регулировать нейрогенез, NS / PCs, способные производить новые нервные клетки, содержали бы рецепторы CB1. Поэтому мы использовали иммуноцитохимию антитела CB1, вестерн-блоттинг и ПЦР для изучения экспрессии белка CB1 и гена в культивируемых NS / PC, выделенных из гиппокампа эмбрионов крыс E17. Около 95% от общего количества клеток , меченной нейросферы Hoeschst пятна также были помечены как CB1 и нестинами (маркер для NS / ПК) антител (рис 1А). Некоторые клетки, меченные Hoechst, в нейросферах имели форму глиальных клеток с небольшими круглыми ядрами и были иммунореактивными в отношении CB1, но без окрашивания нестином (рис. 1 A). Окрашивание антителом CB1 кажется специфичным по двум причинам. Во- первых, Вестерн — блоттинг с тем же антителом и культивируемых NS / PC показал сильную полосу белка с молекулярной массой 60 кДа (рис 1 B), что соответствует рецептора СВ1 (26 ). Во-вторых, мы не смогли обнаружить положительное иммуноокрашивание или полосу белка 60 кДа с использованием антитела CB1, предварительно абсорбированного антигеном. Используя ПЦР, мы дополнительно идентифицировали полосу предсказанного размера (1440 п.н.), соответствующую полной кодирующей области CB1 (рис. 1 C), что позволяет предположить наличие транскриптов CB1 в NS / PC. Сходные результаты, т.е. экспрессия белка CB1 и гена, наблюдались как при втором, так и при шестом пассажах NS / PC. Затем мы исследовали взрослых наивных крыс, умерщвленных через 2 часа после получения однократной дозы BrdU для мечения делящихся клеток. Мы обнаружили, что около 90% окрашенных BrdU клеток в SGZ также были дважды помечены CB1 (рис. 1 D; n= 3). Эти результаты предполагают, что как эмбриональные, так и взрослые NS / PC гиппокампа экспрессируют рецепторы CB1.фигура 1
Экспрессия рецепторов CB1 в NS / PC. ( A ) Коиммунофлуоресцентное окрашивание CB1 и нестина в культивируемых NS / PC гиппокампа, полученных из эмбрионов E17. Окрашивание по Hoechst проводили для выявления всех культивированных клеток. Стрелка указывает на глиальные клетки, расположенные в центре нейросферы, с окрашиванием CB1 и без окрашивания нестином. Масштабная линейка 20 мкм. ( B ) Вестерн-блоттинг с использованием культивированных NS / PC обнаруживает полосу белка 60 кДа, соответствующую рецептору CB1. ( C ) ПЦР показывает экспрессию гена CB1 в NS / PC (дорожка 2) с использованием праймеров, дающих предсказанный продукт размером 1440 п.н. (т.е. полную кодирующую область рецептора CB1) из эмбриональных NS / PC. Дорожка 1: стандарты молекулярной массы; полоса 2: рецептор CB1; дорожка 3: реакция ПЦР без добавления образца. ( D) Конфокальные микроскопические оценки стоимости рецепторов BrdU и CB1 в SGZ, расположенном между воротами и слоем гранулярных клеток (гранулы) зубчатой извилины у взрослой крысы. Масштабная линейка 10 мкм.
Повышенная пролиферация эмбриональных NS / PC с помощью HU210 и AEA. Чтобы исследовать эффекты HU210 на пролиферацию NS / PC, культивируемые эмбриональные NS / PC инкубировали с различными концентрациями HU210. В анализе WST-8 изменения в пролиферации NS / PC между HU210- и обработанной носителем культурой были значительными при некоторых концентрациях HU210, о чем свидетельствуют значительные групповые эффекты с односторонним ANOVA ( F 5,18 = 513,129, P < 0,01). В частности, когда от 10 нМ до 1 мкМ HU210 добавляли к культуральной среде, содержащей митогенные факторы роста bFGF и EGF, анализ WST-8 показал значительное увеличение пролиферации NS / PC (апостериорные тесты Тьюки, P <0,05). ; 1 нМ HU210 не оказал значительного воздействия ( P= 0,072); 10 мкМ оказывали сильное токсическое воздействие на культивируемые NS / PC (рис. 2 A). Поскольку HU210 может активировать как рецепторы CB1, так и CB2, далее мы использовали селективный антагонист рецепторов CB1 AM281, чтобы идентифицировать возможное участие CB1 в действии HU210 на пролиферацию NS / PC. Хотя от 1 нМ до 1 мкМ только AM281 не оказывал значительного воздействия на пролиферацию NS / PC, от 10 до 1 мкМ AM281 блокировал стимулирующие эффекты от 10 до 1 мкМ HU210 на пролиферацию NS / PC (однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для повторных меры, F 2,25.713 = 16,792, Р <0,01; попарное сравнение, обработанных HU-210 клеток с или без AM281: P <0,01) (рис 2A), предполагая, что HU210 специфически действует на рецепторы CB1, способствуя пролиферации NS / PC. Хотя только 10 мкМ AM281 значительно ингибировали пролиферацию NS / PC ( P <0,01), эта концентрация AM281 не оказывала значительного воздействия на предотвращение летальных эффектов 10 мкМ HU210 на NS / PC (рис. 2 A), что указывает на то, что летальные эффекты 10 мкМ HU210 на клетки NS / PC были вызваны неспецифически или другим рецептором.фигура 2
Влияние каннабиноида HU210 на пролиферацию культивируемых NS / PC гиппокампа. ( A ) В анализе WST-8 инкубация NS / PC с 10 нМ до 1 мкМ HU210 в течение 48 часов значительно способствовала пролиферации NS / PC, которая блокировалась антагонистом рецептора CB1 AM281. Сам по себе AM281 значительно снижал пролиферацию NS / PC только с 10 мкМ, но эта концентрация AM281 не способна блокировать летальные эффекты 10 мкМ HU210 на NS / PC. ( Б ) BrdU включение анализ подтвердил результаты , полученные с помощью анализа WST-8 , показанного на A . ( C ) Инкубация NS / PC с 1 мкМ до 10 мкМ AEA в течение 48 часов значительно способствовала пролиферации NS / PC в анализе WST-8. ( D) Применение от 10 нМ до 1 мкМ HU210 значительно стимулировало пролиферацию NS / PC как в присутствии, так и в отсутствие факторов роста bFGF и EGF в культуральной среде. ( E ) Коклюш (PTX; 100 нг / мл), селективный блокатор активации белка G i / o , предотвращал эффекты от 10 нМ до 1 мкМ HU210 на стимулирование пролиферации NS / PC. ( F ) Инкубация NS / PC с 1 мг / мл холерного токсина, селективного активатора G s , стимулировала значительное увеличение накопления цАМФ в NS / PC через 0,5, 1, 2 и 24 часа после добавления холерного токсина. ( G ) Инкубация NS / PC с 1 мг / мл холерного токсина в течение 0,5, 1, 2, 24 или 48 часов не вызвала значительного изменения пролиферации NS / PC. Планки погрешностей представляют SEM. *P <0,05 и ** P <0,01 по апостериорным тестам Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа.
Для подтверждения эффектов от 10 нМ до 1 мкМ HU210 на стимулирование пролиферации NS / PC, как было ранее оценено с помощью анализа WST-8, использовали анализ включения BrdU. Он измеряет пролиферацию клеток, обнаруживая делящиеся клетки. Подобно результатам анализа WST-8, односторонний дисперсионный анализ показал значительные групповые эффекты ( F 5,18 = 176,004; P <0,01); Апостериорные тесты Тьюки показали, что от 10 нМ до 1 мкМ HU210 значительно увеличивает пролиферацию NS / PC ( P <0,05), которая блокируется от 10 до 1 мкМ селективного антагониста рецептора CB1 AM281 (однофакторный ANOVA для повторных измерений , F 2,36 = 19,081, P <0,01; попарные сравнения, клетки, обработанные HU210 с или без AM281: P<0,01) (рисунок 2 B).
Для определения эффектов эндогенного каннабиноида AEA на пролиферацию NS / PC культивируемые NS / PC инкубировали с различными концентрациями AEA. Анализ WST-8 показал значимые групповые эффекты с односторонним дисперсионным анализом ( F 5,18 = 61,585, P <0,01). Апостериорные тесты Тьюки также показали, что от 1 мкМ до 10 мкМ AEA значительно увеличивают пролиферацию NS / PC ( P <0,05) в присутствии bFGF и EGF; 100 мкМ вызывали токсические эффекты (рисунок 2 C).
Чтобы изучить возможность того, способен ли сам HU210 вызывать митогенные эффекты, мы дополнительно исследовали пролиферацию NS / PC путем добавления различных концентраций HU210 в культуральную среду с митогенными факторами роста bFGF и EGF или без них. Когда bFGF и EGF отсутствовали в культуральной среде, после нанесения HU210 наблюдалось значительное общее изменение пролиферации NS / PC ( F 5,30 = 219,076, P <0,01) (рис. 2 D). В частности, от 10 нМ до 1 мкМ HU210 без факторов роста вызывали значительные митогенные эффекты на NS / PC (апостериорные тесты Tukey, P<0,05), тогда как 10 мкМ HU210 убивали клетки. Аналогичные результаты наблюдались в контрольной культуре , когда различные концентрации HU-210 были добавлены к культуральной среде , содержащей митогенную факторы роста ( F 5,30 = 194.429, P <0,01; Тьюки апостериорных испытания, P <0,05) (рис 2 D ). Тем не менее, базальные уровни пролиферации с bFGF и EGF были значительно выше, чем у уровней без bFGF и EGF ( однофакторный дисперсионный анализ для повторных измерений, F 1,30 = 214,703, P <0,01; парные сравнения: P <0,01) (Рисунок 2 D ).
Внутриклеточная передача сигналов участвует в индуцированной HU210 пролиферации NS / PC. Чтобы изучить механизмы, лежащие в основе действия HU210 на пролиферацию NS / PC, мы исследовали внутриклеточные сигнальные пути. Стимуляция рецептора CB1 активирует G i / o или G s белки ( 27 ,28 ). Чтобы проверить,опосредуетлибелокG i / o эффекты HU210, мы добавили токсин коклюша, селективный блокаторактивации белкаG i / o , в культуральную среду за 4 часа до обработки HU210. Опять же, от 10 нМ до 1 мкМ HU210 значительно увеличивали пролиферацию NS / PC (односторонний дисперсионный анализ, F 5,18 = 880,629, P <0,01;апостериорныетесты, P <0,01 между контролем и каждой из 3 концентраций HU210. ), который полностью блокировался 100 нг / мл коклюша (однофакторныйдисперсионный анализ для повторных измерений, F 1,18 = 41,64, P <0,01; попарные сравнения, клетки, обработанные HU210 с коклюшем или без него: P<0,01) (Рисунок 2 E). Было показано, что HU210 активирует белки G s, когда белки G i / o ингибируются токсином коклюша ( 27 ). Таким образом, чтобы определить, достигается ли блокирующее действие HU210-индуцированной пролиферации NS / PC после лечения коклюша активацией G s- белков, мы исследовали эффекты холерного токсина, активатора G s- белка, на пролиферацию NS / PC. Инкубация NS / PC с 1 мг / мл холерного токсина стимулировала примерно 14-, 80-, 90- и 13-кратное увеличение накопления цАМФ в NS / PC через 0,5, 1, 2 и 24 часа после добавления холеры. токсин; Продукция цАМФ вернулась к базальным уровням через 48 часов после токсина холеры (1-way ANOVA, F5,18 = 93,341, P <0,01) (рисунок 2 F). Эти результаты указывают на эффективную активацию белков G s в NS / PC токсином холеры. Однако не наблюдалось значительных изменений в пролиферации NS / PC через 0,5, 1, 2, 24 и 48 часов после добавления холерного токсина ( однофакторный дисперсионный анализ, F 5,18 = 76,562, P = 0,86) (Рисунок 2 G ). Эти результаты вместе предполагают участие белков G i / o , но не белков G s , в индуцированной HU210 пролиферации NS / PC.
Поскольку белок G i / o активирует передачу сигналов PI3K / Akt и ERK ( 29 ), которые, как хорошо известно, играют важную роль в росте и гибели клеток, мы изучили, может ли HU210 активировать Akt и ERK1 / 2. Не было значительного изменения фосфорилирования фосфо-Akt в течение первого часа после нанесения HU210 ( F 4,10 = 1,693, P = 0,228) (рис. 3 A), что указывает на то, что сигнальный путь PI3K / Akt не участвует в действие HU210 на пролиферацию NS / PC. Напротив, изменения фосфорилирования фосфо-ERK1 / 2 (pERK1 / 2) в течение первого часа после нанесения HU210 были значительными в определенные моменты времени, как показано с помощью однофакторного дисперсионного анализа (с факторами роста, F 4,15).= 33,698, P <0,01; без факторов роста, F 4,15 = 23,513, P <0,01). Уже через 5 минут после добавления HU210 в культуральную среду с (рис. 3 B) или без bFGF и EGF (рис. 3 C) наблюдалось 2,5-кратное увеличение фосфорилирования pERK1 / 2 ( P <0,05). Через 15 минут после нанесения HU210 фосфорилирование pERK1 / 2 достигло пикового уровня, который был примерно в 4 раза (с факторами роста) или 7 раз (без факторов роста) по сравнению с контролем ( P <0,01). На 60 — й минуте после добавления, HU-210 фосфорилирования pERK1 / 2 либо значительно снизилось ( P <0,05) (рис 3B) или вернулся на уровень предварительной обработки (Рисунок 3 C). Мы не наблюдали каких-либо значительных изменений в общей ERK1 / 2 в течение первого часа после нанесения HU210. Таким образом, значительное увеличение pERK1 / 2 в этот период предполагает важное участие пути передачи сигналов ERK в действии HU210, способствуя пролиферации NS / PC. Эта гипотеза была подтверждена дальнейшими экспериментами, в которых использовался U0126, специфический ингибитор пути ERK. На Фигуре 3 D показано общее значимое различие в фосфорилировании pERK1 / 2 после применения носителя или 100 нМ HU210 с 10 мкМ U0126 или без него ( F 3,8 = 60,769, P <0,01). В частности, HU210 значительно увеличивал фосфорилирование pERK1 / 2 ( P<0,01), который был практически полностью заблокирован U0126 ( P <0,01). Параллельный эксперимент продемонстрировал, что U0126 блокирует стимулирующие эффекты 100 нМ HU210 на пролиферацию NS / PC (однофакторный ANOVA для повторных измерений, F 1,17 = 6,356, P <0,05; попарные сравнения, клетки, обработанные HU210, с или без U0126: P <0,05) (Рисунок 3 E).Рисунок 3
Влияние каннабиноида HU210 на передачу сигналов PI3K / Akt и ERK в культивируемых NS / PC гиппокампа. ( A ) Не было значительного изменения pAkt или актина в NS / PC в течение первого часа после добавления 100 нМ HU210 в культуральную среду. ( B ) Применение 100 нМ HU210 быстро индуцировало фосфорилирование pERK1 / 2 в NS / PC в присутствии bFGF и EGF в культуральной среде. ( C ) Применение 100 нМ HU210 через 3 часа после удаления bFGF и EGF из культуральной среды также индуцировало фосфорилирование pERK1 / 2 в NS / PC. ( D ) Применение ингибитора передачи сигналов ERK U0126 блокировало стимулирующие эффекты 100 нМ HU210 на фосфорилирование pERK1 / 2 в NS / PC через 5 минут после добавления HU210 в культуральную среду. ( E) Добавление U0126 (10 мкМ) в культуральную среду за 1 час до HU210 антагонизировало стимулирующие эффекты от 10 нМ до 1 мкМ HU210 на пролиферацию NS / PC. Планки погрешностей представляют SEM. * P <0,05 и ** P <0,01 по апостериорным тестам Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа. tERK1 / 2, всего ERK1 / 2.
HU210 и AEA не влияют на дифференцировку нейронов культивируемых NS / PC. Чтобы изучить влияние HU210 на дифференцировку нейронов культивируемых NS / PC, нейросферы диссоциировали, высевали и культивировали в среде, содержащей bFGF и EGF, в течение 1 дня, а затем в другой среде, содержащей различные концентрации HU210 без bFGF или EGF, в течение 8 дней. . После фиксации проводили иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител против нейронального маркера β-тубулина III (TuJ1) с последующим окрашиванием Hoechst, которое выявляет все культивируемые клетки. Подсчет клеток не выявил значительной разницы между соотношениями TuJ1-меченых нейронов и общих клеток, меченных Hoechst, после обработки носителем или 10 нМ, 100 нМ или 1 мкМ HU210 (1-way ANOVA, F 4,20 = 3,307, P= 0,324) (рис. 4 ), что позволяет предположить, что HU210 не оказывает значительного влияния на дифференцировку нейронов культивируемых NS / PC. Подобно HU210, AEA (1 и 5 мкМ) не оказывал значительного влияния на дифференцировку нейронов культивируемых NS / PC (1-way ANOVA, F 2,9 = 0,177, P = 0,840) (рис. 4 B).Рисунок 4
Влияние HU210 и AEA на дифференцировку нейронов культивируемых NS / PC гиппокампа. ( A ) Инкубация NS / PC с культуральной средой, содержащей либо носитель, либо 100 нМ HU210 без факторов роста, в течение 8 дней приводила к аналогичной плотности нейронов (розовых клеток), окрашенных антителом TuJ1. Все культивируемые клетки помечены темно-синим окрашиванием по Хехсту. ( B ) Не было значительной разницы в соотношении TuJ1-меченых нейронов к общему количеству клеток после нанесения HU210 (от 10 нМ до 1 мкМ) или AEA (1 или 5 мкМ) в культуральную среду.
Повышенная пролиферация клеток гиппокампа после лечения HU210 у взрослых крыс. Мечение делящихся клеток BrdU использовали для тестирования острых эффектов лечения HU210 на пролиферацию клеток в гиппокампе взрослых. Взрослые крысы получали однократную дозу носителя AM281 (3 мг / кг, внутрибрюшинно) или HU210 (25 или 100 мкг / кг, внутрибрюшинно) с последующим введением через 2 часа BrdU и перфузией через 1 день. BrdU меченые клетки показали веретеновидные или неправильную форму и были сгруппированы или агрегировать в SGZ (рис 5 A) в течение всего гиппокампа в исследовались все крысы. Подсчет клеток не выявил значительного изменения количества BrdU-положительных клеток в SGZ у крыс, получавших носитель, AM281 или HU210 (1-way ANOVA, F 3,16 = 52,784, P = 0,58;n = 5) (Рисунок 5 B). Затем мы исследовали влияние хронической инъекции HU210 на пролиферацию клеток гиппокампа взрослых. Через два часа после получения последней дозы дважды в день инъекций носителя AM281 (3 мг / кг, внутрибрюшинно) или HU210 (25 или 100 мкг / кг, внутрибрюшинно) в течение 10 дней взрослым крысам Long-Evans вводили BrdU и затем перфузировали через 1 день. Иммуногистохимическое окрашивание показало очевидное увеличение плотности BrdU-меченых клеток в SGZ после хронического введения 100 мкг / кг HU210 (фигура 5 C). Однофакторный дисперсионный анализ показал значительную общую разницу в среднем значении ± SEM для BrdU-положительных клеток в SGZ ( F 3,16 = 11,504, P <0,001; n = 5) (рис.5 D). Апостериорный тест Тьюки показал значительное увеличение (около 40%) количества BrdU-меченных клеток после 100 мкг / кг HU210 ( P <0,05), но не 25 мкг / кг HU210 ( P = 0,979), по сравнению с автомобиль (Рисунок 5 D). Инъекция AM281, по-видимому, уменьшала количество BrdU-положительных клеток в SGZ, но не было значимой разницы по сравнению с контролем ( P = 0,099).Рисунок 5
Влияние обработки HU210 на пролиферацию клеток в зубчатой извилине у взрослых крыс ( n = 5–7 крыс в каждой группе). Клеточную пролиферацию оценивали по метке делящихся клеток BrdU. ( A ) Репрезентативные микрофотографии зубчатой извилины показывают BrdU-положительные клетки, сгруппированные или агрегированные в SGZ у крыс, получивших острую инъекцию носителя или 100 мкг / кг HU210. Масштабная линейка 60 мкм. ( B ) Не было значительной разницы в среднем количестве клеток, окрашенных BrdU, в зубчатой извилине на срез после 1 дозы носителя для острых заболеваний, 100 и 25 мкг / кг HU210 и 3 мг / кг AM281. ( CТипичные микрофотографии зубчатой извилины показывают, что инъекции 100 мкг / кг HU210 два раза в день в течение 10 дней, по-видимому, увеличивали плотность BrdU-положительных клеток в SGZ по сравнению с хронической инъекцией носителя. Масштабная линейка 60 мкм. ( D ) По сравнению с инъекцией носителя наблюдалось значительное увеличение количества BrdU-иммунореактивных клеток в зубчатой извилине после хронического лечения 100 мкг / кг HU210, но не 25 мкг / кг HU210 или 3 мг / кг AM281. Планки погрешностей представляют SEM. * P <0,05 по результатам апостериорных тестов Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа.
Увеличение количества нейронов гиппокампа новорожденных после хронического лечения HU210 у взрослых крыс. Недавнее исследование показало, что новорожденные нейроны в слое зубчатых гранулярных клеток, которые выжили 4 недели, стабильно интегрировались в слой гранулярных клеток ( 30 ). Чтобы изучить выживание, миграцию и дифференцировку индуцированных HU210 новорожденных клеток в SGZ, мы вводили крысам два раза в день HU210 (100 мкг / кг, внутрибрюшинно), AM281 (3 мг / кг) или носитель в течение 10 дней с последующим введением 12 часов спустя 4 инъекции BrdU с 12-часовыми интервалами. Через месяц после последней инъекции HU210, AM281 или носителя большинство BrdU-меченых клеток мигрировали и рассеялись в слое гранулярных клеток и показали размер и морфологию, неотличимые как от соседних с ними нейронов гранул, так и от другого лечения (рис.6 А). Количество зубчатых клеток, меченных BrdU, у крыс, получавших HU210, было значительно выше, чем у крыс, получавших носитель ( t- критерий Стьюдента, P <0,01; n = 5) (рис. 6 B), что указывает на то, что большая часть хронических HU210-индуцированных новорожденные клетки выжили. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало , что HU210- и транспортные средства , обработанные крысы показали аналогичную долю BrdU / нейрональный ядерный антиген (BrdU / NeuN) двойная маркировка клеток к общим BrdU-меченым клеткам (Стьюдент т тест, P = 0,977) (рис 6C), предполагая, что хронические индуцированные HU210 новорожденные клетки в SGZ имеют коэффициент нейрональной дифференцировки, аналогичный таковому у новорожденных клеток, индуцированных носителем в SGZ. Тем не менее, поскольку хроническое лечение HU210 значительно увеличивало количество BrdU-меченых новорожденных клеток в зубчатой извилине (рис. 6 B), общее количество новорожденных нейронов, дважды меченных BrdU / NeuN в зубчатой извилине, также значительно увеличивалось после хронической HU210.Рисунок 6
Судьба и миграция BrdU-меченных клеток в зубчатой извилине после хронического лечения HU210. После получения дважды в день инъекций носителя или 100 мкг / кг HU210 в течение 10 дней крысам делали 4 инъекции BrdU с последующей перфузией через 1 месяц. ( A ) Репрезентативные изображения конфокальной микроскопии показывают выделение (желтый) BrdU (зеленый) и NeuN (красный) в слое зубчатых гранул. Большинство клеток, окрашенных BrdU, дважды метятся нейрональным маркером NeuN и располагаются в слое гранулярных клеток. Трехмерная трехмерная фотография дважды окрашенных нейронов, указанных стрелками. Масштабная линейка 20 мкм. ( B ) Хронический HU210 значительно увеличивал количество клеток, окрашенных BrdU, в зубчатой извилине ( n = 5 в каждой группе). ( C) Не было существенной разницы в доле клеток, дважды меченных BrdU и NeuN, по отношению к общему количеству клеток, однократно меченных BrdU. Планки погрешностей представляют SEM. ** P <0,01 по Стьюдента т испытания.
Отсутствие гибели нейронов гиппокампа после хронического лечения HU210 у взрослых крыс. Многочисленные доказательства проиллюстрировали усиление нейрогенеза гиппокампа после ишемии, эпилептического статуса, обогащенной окружающей среды или физических упражнений ( 15 ). Следовательно, возможно, что усиление нейрогенеза в гиппокампе после хронического лечения HU210 у взрослых крыс может быть результатом токсических эффектов хронического лечения HU210 на нейроны гиппокампа. Чтобы изучить эту возможность, мы исследуем общее количество зубчатых гранул и пирамидных нейронов CA3 после инъекций HU210 (100 мкг / кг) два раза в день в течение 10 дней. Как показано на Рисунке 7Крысы, обработанные HU210, не показали заметной потери NeuN-иммунопозитивных нейронов в гиппокампе по сравнению с наивными контрольными крысами. Стереологический подсчет клеток подтвердил отсутствие существенной разницы в общем количестве зубчатых гранулярных клеток ( F 1,4 = 1,443, P = 0,782) и пирамидных нейронов CA3 ( F 1,4 = 5,099, P = 0,553) между наивными и HU210- обработанных крыс (рис. 7 B). Эти результаты, однако, не исключает возможности того, что некоторые из нейронов NeuN-пятно после хронического лечения HU-210 показано на рисунке 7 А, умирает . Соответственно, мы использовали окрашивание TUNEL и окрашивание Fluoro-Jade B для исследования дегенерирующих нейронов гиппокампа (31 ) у крыс, получавших хроническое лечение HU210, с наивными крысами в качестве отрицательного контроля и крыс, получавших каиновую кислоту, в качестве положительного контроля (31 ). Нам не удалось обнаружить никаких дегенерирующих клеток, окрашенных TUNEL или Fluoro-Jade B, по всему гиппокампу как у наивных крыс, так и у крыс, получавших HU210, тогда как у крыс, которым вводили каиновую кислоту, с эпилептическим статусом, обнаруживалось множество умирающих клеток в слое пирамидных клеток CA3 и ровный зубчатый слой гранулярных клеток (рис. 7 , C и D).Рисунок 7
Влияние хронического HU210 на выживаемость нейронов. ( A ) Как наивные контрольные крысы, так и крысы, получавшие дважды в день инъекции HU210 (100 мкг / кг) в течение 10 дней, показали одинаковую плотность NeuN-окрашенных нейронов в слое зубчатых гранулярных клеток и слое пирамидных клеток CA3. ( B ) Не было значительной разницы в общем количестве NeuN-окрашенных клеток в слое зубчатых гранулярных клеток и пирамидном слое CA3 между наивными и обработанными HU210 крысами ( n = 3 для каждой группы). ( C ) В то время как у наивных крыс и крыс, подвергавшихся хроническому лечению HU210, не было обнаружено TUNEL-окрашенных клеток в гиппокампе, обработанные каиновой кислотой (обработанные KA) крысы показали многочисленные TUNEL-положительные нейроны в слое пирамидных клеток CA3 и слое зубчатых гранул. ( DВ то время как у наивных крыс и крыс, подвергавшихся хроническому лечению HU210, не было обнаружено клеток, окрашенных флуоро-нефритом B (окрашенных FJB) в гиппокампе, у крыс, обработанных каиновой кислотой, наблюдались многочисленные фтор-нефрит B-положительные нейроны в слое пирамидных клеток CA3 ( n = 3 для каждой группы). Масштабная линейка 60 мкм.
Анксиолитический и антидепрессивный эффекты хронического HU210. Два недавних исследования с использованием тестов с подавлением новизны (NSF) и теста принудительного плавания (FST) в качестве показателей тревоги и депрессии показали, что длительное лечение антидепрессантом флуоксетином вызывает анксиолитический и антидепрессивный эффекты ( 18 ,19 ), а анксиолитические эффекты, вероятно, достигаются за счет стимуляции нейрогенеза в гиппокампе (18 ). Поэтому мы использовали те же поведенческие тесты, чтобы изучить влияние хронического лечения HU210 на показатели тревоги и депрессии. Крысы получали два раза в день инъекции носителя, AM281 (3 мг / кг) или HU210 (100 мкг / кг) в течение 10 дней с последующими 12 часами спустя 4 инъекции BrdU с 12-часовыми интервалами. Через 1 месяц крыс подвергали поведенческому тестированию на основании недавнего открытия, что новорожденным нейронам гиппокампа требуется 4 недели, чтобы они начали функционировать (32 ). В тесте NSF односторонний дисперсионный анализ показал общую значительную разницу в латентномпериоде приемапищи в новой среде среди 3 групп крыс, лишенных пищи в течение 48 часов ( F 2,20 = 8,187, P <0,01). Как показано на фигуре 8 A,отношению к лечению транспортного средства, хронический (HU-210но не AM281) лечения значительно снижается время ожиданиячтобы поесть пищи в новой среде ( P <0,01). Однако, когда возвращались в свои родные клетки сразу же после испытания, крысполучавших носитель, хронический AM281 и хронический не показал HU-210 существенной разницы в латентности в пищу ( F 2,20 = 0,276, P = 0,762) (рис 8A) или количество потребленной пищи ( F 2,20 = 0,839, P = 0,447). В FST была общая значимая разница в продолжительности неподвижности среди крыс, получавших носитель, AM281 и HU210 ( F 2,19 = 4,441, P <0,05). После специального тест показал , что HU-210 (но не AM281) значительно снизился неподвижности ( P <0,05) (рис 8 В), в то время как ни AM281 , ни HU-210 дает значительное воздействие на количестве крыс восхождения в первых 5 минутах в претесте сессий FST ( F 2,19 = 7,552, P = 0,887) (Рисунок 8C). Крыс умерщвляли для иммуногистохимического окрашивания после поведенческих тестов. Большинство BrdU-положительных клеток у крыс, получавших носитель, AM281 или HU210, располагались в слое гранулярных клеток, что позволяет предположить, что они стали гранулярными нейронами. Подсчет клеток выявил общую значительную разницу в количестве клеток, окрашенных BrdU, в зубчатой извилине ( F 2,19 = 3,896, P <0,05). После специального тест показал результаты , аналогичные тем , которые на рисунке 5 D , а именно: по отношению к обработанному носителем крысам, HU-210-обработанные крысы продемонстрировали значительное увеличение ( P <0,05) в количестве BrdU-положительных клетки в зубчатой извилине, тогда как Крысы, получавшие AM281, не показали значительной разницы ( P= 0,165). Таким образом, эти данные вместе предполагают, что хроническое лечение HU210 способствовало нейрогенезу гиппокампа и оказывало анксиолитические и антидепрессантные эффекты.Рисунок 8
Влияние хронического HU210 на тест NSF, FST и пролиферацию клеток в зубчатой извилине. После получения хронических инъекций носителя, AM281 или HU210 в течение 10 дней крысам вводили BrdU для маркировки делящихся клеток, затем через 1 месяц проводилось поведенческое тестирование и через 1 день путем перфузии ( n = 7-8 для каждой группы в A — C ; n = 5 для каждой группы в D — F ). ( A ) В тесте NSF крысы, получавшие хронический HU210 (но не AM281), показали значительно сокращенную латентность при кормлении в новой среде, но не в своих домашних клетках, что предполагает анксиолитический эффект, вызываемый HU210. ( B) В FST хронический HU210 (но не AM281) значительно сокращал продолжительность неподвижности (т.е. эффекты, подобные антидепрессантам). ( C ) Среди крыс, получавших носитель, AM281 и HU210, не было значительной разницы в количестве подъемов в первые 5 минут во время предварительных тестов FST. ( D ) Облучение гиппокампа заметно снижает пролиферацию клеток в SGZ. ( E ) Облучение гиппокампа блокировало хроническое индуцированное HU210 сокращение латентного периода у крыс при кормлении в новой среде, но не в их домашних клетках в тесте NSF. ( F ) Облучение гиппокампа предотвращало хроническое индуцированное HU210 сокращение продолжительности неподвижности в FST. Планки погрешностей представляют SEM. * P <0,05 и **P <0,01 по апостериорным тестам Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа.
Связь нейрогенеза гиппокампа с анксиолитическими и антидепрессантными эффектами хронического HU210. Чтобы определить взаимосвязь между нейрогенезом гиппокампа и анксиолитическими и антидепрессантными эффектами, вызываемыми хроническим HU210, мы исследовали эффекты избирательного разрушения нервных стволовых клеток гиппокампа на поведенческие эффекты хронического HU210. Во время курса хронических инъекций HU210 1 группа крыс Long-Evans получила две дозы рентгеновского излучения по 5 Гр, ограниченные ограниченной областью мозга, включая гиппокамп, как описано ранее ( 18 ). После последней инъекции HU210 были сделаны четыре инъекции BrdU с 12-часовыми интервалами. Облучение гиппокампа вызывало заметное уменьшение количества BrdU-положительных клеток в SGZ ( F 2,12= 6,011, P <0,01) (рис. 8 D) и блокаду хронических индуцированных HU210 анксиолитических эффектов ( F 2,12 = 4,209, P <0,05) (рис. 8 E) и антидепрессантов ( F 2, 12 = 9,100, P <0,05) (Рисунок 8 F) без значительного влияния на количество потребляемой пищи, когда крыс возвращали в их домашние клетки ( F 2,12 = 2,376 P = 0,502) (Рисунок 8 E) и время подъема ( F 2,12 = 9,113, P= 0,624). Поскольку не было обнаружено, что две дозы рентгеновского излучения в дозе 5 Гр изменяют морфологию и функцию зрелых нейронов в гиппокампе, гипоталамусе и миндалине ( 18 ), наши результаты вместе предполагают, что хроническое лечение HU210 снижает тревожность и депрессию, вероятно, за счет стимулирования гиппокампальный нейрогенез.
